Para os cogumelos o composto mais utilizado é uma mistura de vários substratos, tendo como base o resíduo de tora de eucalipto (serragem) suplementado com farelos de trigo, arroz ou outro cereal. Após a mistura, normalmente é efetuada a adição de carbonato de cálcio ou dolomita como fonte de cálcio e para a correção do pH que deve estar em torno de 4.

O cultivo também pode ser efetuado com a utilização de vários resíduos lignocelulósicos como substratos, tais como palhas de cereais, bagaço de cana-de açúcar, serragens, casca de frutas, folhas de bananeira, restos de papel, resíduos cítricos, polpa de café, entre outros. Na maioria dos cultivos, estes substratos são misturados a outras fontes nutricionais, com destaque para os farelos e uréia. A suplementação do substrato com farelos, principalmente, o de trigo, proporciona um aumento do teor de determinados elementos, como Fe e Mg.

O substrato é o maior responsável pela fonte de nutrientes e água para o posterior desenvolvimento do cogumelo e é também o que sustenta o cultivo. Devido ao seu alto grau de importância no processo, é preciso que se tenha cuidados especiais em sua formulação. A falta de cuidados com o substrato faz com que os microorganismos o colonizem muito antes fungo desejado. Os substratos ricos são submetidos a compostagem, pasteurização e condicionamento. Esse processo demora de 21 a 30 dias e, quando chega ao fim, ele está parcialmente estabilizado e condicionado. Existem alguns organismos termófilos, antagônicos ao shiitake, que apenas são mortos quando elevados a altíssimas temperaturas. Por isso o correto manuseio do substrato é fundamental para o sucesso do cultivo.

Os substratos para o cultivo axênico em blocos precisam ser em sacos resistentes a 125ºC, ou seja, o polipropileno ou o polietileno de alta densidade, serragem enriquecida de nutrientes e condições ambientais controladas ou semi-controladas.

A formulação para os substratos de pasteurização severa é menos nutritiva para que os nutrientes usados não possibilitem a proliferação de microorganismos. Com C/N entre 50 e 65/1, o que pode envolver inúmeras combinações de matérias-primas.

Como o substrato é um dos fatores de maior importância no cultivo dos cogumelos é preciso que seu preparo seja feito com o máximo de cuidado possível.

Primeiro se escolhe o material a ser usado. No caso da serragem (quem deve estar fresca e não conter mofo), o primeiro passo é o seu peneiramento. Isso acontece porque a serragem contém pedaços de madeiras ou outros materiais duros que precisam ser retirados, pois se ficam podem causar perfurações nos sacos, e essas perfurações facilitam a entrada de microorganismos contaminantes.

A composição do material deve ser bastante estável não estando nem muito fina, pois dessa forma compacta demasiadamente o bolo, e nem muito grosso, pois, dessa maneira, forma bolsões de ar que diminuem a produção. Depois de misturados os substratos devem ser colocados nos sacos apropriados e a quantidade a ser adicionada varia de acordo com o tamanho do saco, que é normalmente de um quilo e meio a quatro quilos.

Depois de prontos os substratos são levados para a autoclave, máquina que funciona como uma panela de pressão, e elevados a uma temperatura de 121ºC por duas horas ou mais. Na pasteurização severa a temperatura é aumentada a partir da emissão de vapor, mas sob pressão ambiente. Os bolos devem permanecer nesse ambiente por um período de seis a 10 horas. Essa diferença de tempo existe devido ao fato de que na pasteurização severa a temperatura é mais baixa. A autoclavagem, no processo axênico, é de alto custo de implantação, contudo é a única forma eficiente para esterilização do material. A pasteurização severa tem custo inferior e é indicada quando o cultivo do cogumelo acontece em galpões.

A serragem é componente mais comum nos substratos, pois são ricos em nitrogênio e em outros nutrientes. Palhas de capim e bagaço de cana-de-açúcar também são materiais utilizados, são ricos em carbonos e pobres em nitrogênio e fósforo. Como existe uma interação significativa entre linhagem e substrato é fundamental que um comerciante de inóculo os teste antes de colocá-lo em comercialização. É preciso saber sua produtividade, qualidade e características do fungo. Saber em que tipo de substrato e qual método de cultivo elas se desenvolvem melhor também é importante.

Após o resfriamento do substrato, deve ser inoculado o micélio do fungo. O inóculo  deve ser de linhagem selecionada para as condições de cultivo. Depois de selecionado, a inoculação pode acontecer em dois diferentes tipos de ambientes: Câmaras de fluxo laminar para o cultivo axênico ou em salas de inoculação, no caso de pasteurização severa. No primeiro caso, as câmaras geram um ambiente estéril no momento de introduzir o spawn nos sacos.

Antes que o substrato seja tomado pelo micélio, acontece a colonização. Essa etapa ocorre logo após a inoculação. Logo após essa etapa, o micélio começa a atingir sua estabilidade e, finalmente, o endurecimento do bolo. Quando o bolo for considerado pronto para a frutificação o saco plástico pode ser retirado completamente e o bolo colocado em local úmido. Também é possível abrir furos no saco, por onde o cogumelo nascerá, diminuindo a chance de contaminação.

Para que a frutificação aconteça com sucesso é preciso manter condições ótimas durante a fase de produção. Na fase de frutificação os fatores fundamentais são a umidade relativa do ar, temperatura e conservação de oxigênio. Essas condições podem ser obtidas com a instalação de nebulizadores, vaporizadores ou, no caso de uma câmara de frutificação pequena e caseira, bandejas com perlita úmida. Esses nebulizadores e vaporizadores devem ser acionados frequentemente, porém por um período curto de tempo. Em galpões sofisticados é possível instalar sensores para que ocorra esse controle, usando Arduino.